naidheachdan

Tha IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) na analog de substrate β-galactosidase, a tha gu math so-ruigsinneach.Fo inntrigeadh IPTG, faodaidh an inducer iom-fhillte a chruthachadh leis a’ phròtain repressor , Gus am bi co-chòrdadh a ’phròtain repressor air atharrachadh, gus nach gabh a chur còmhla ris a’ ghine targaid, agus gu bheil an gine targaid air a chuir an cèill gu h-èifeachdach.Mar sin ciamar a bu chòir an dùmhlachd de IPTG a dhearbhadh rè an deuchainn?A bheil am fear as motha nas fheàrr?
An toiseach, tuigidh sinn prionnsapal inntrigidh IPTG: tha trì ginean structarail ann an lactose operon (eileamaid) E. coli, Z, Y, agus A, a tha a’ còdachadh β-galactosidase, permease, agus acetyltransferase, fa leth.lacZ hydrolyzes lactose a-steach glucose agus galactose, no a-steach allo-lactose;Tha lacY a’ leigeil le lactose san àrainneachd a dhol tron ​​memblan cealla agus a dhol a-steach don chill;Bidh lacA a’ gluasad a’ bhuidheann acetyl bho acetyl-CoA gu β-galactoside, a tha a’ toirt a-steach toirt air falbh buaidh puinnseanta.A bharrachd air an sin, tha sreath obrachaidh O, sreath tòiseachaidh P agus gine riaghlaidh I. Is e pròtain repressor a th’ anns a ’chòd gine I a dh’ fhaodas ceangal a dhèanamh ri suidheachadh O den t-sreath gnìomhaiche, gus am bi an operon (meta) air a bhruthadh agus tionndadh dheth.Tha làrach ceangail ann cuideachd airson làrach ceangail pròtain-CAP gine catabolic suas an abhainn bhon t-sreath tòiseachaidh P. Tha an t-sreath P, an t-sreath O agus an làrach ceangail CAP còmhla mar roinn riaghlaidh den lac operon.Tha ginean còdaidh nan trì enzyman air an riaghladh leis an aon roinn riaghlaidh gus faireachdainn co-òrdanaichte de thoraidhean gine a choileanadh.

Às aonais lactsa, tha an lac operon (meta) ann an staid ro-aithris.Aig an àm seo, tha an repressor lac air a chuir an cèill leis an t-sreath I fo smachd an t-sreath adhartaiche PI a ’ceangal ris an t-sreath O, a chuireas casg air RNA polymerase bho bhith ceangailte ri sreath P agus a’ cur bacadh air tòiseachadh tar-sgrìobhaidh;Nuair a tha lactose an làthair, faodar an lac operon (meta) a thoirt a-steach Anns an t-siostam operon (meta) seo, chan e lactose fhèin an fhìor inducer.Bidh lactas a 'dol a-steach don chill agus tha e air a chatalachadh le β-galactosidase gus a thionndadh gu allolactose.Bidh an tè mu dheireadh, mar mholacile inducer, a 'ceangal ris a' phròtain repressor agus ag atharrachadh co-chòrdadh a 'phròtain, a tha a' leantainn gu sgaradh a 'phròtain repressor bhon t-sreath O agus tar-sgrìobhadh.Tha an aon bhuaidh aig Isopropylthiogalactoside (IPTG) ri allolactose.Tha e na inducer gu math cumhachdach, nach eil air a mheatabolachadh le bacteria agus tha e gu math seasmhach, agus mar sin tha e air a chleachdadh gu farsaing ann an deuchainn-lannan.

Ciamar a cho-dhùineas tu an dùmhlachd as fheàrr de IPTG?Gabh E. coli mar eisimpleir.
Chaidh an strain E. coli BL21 le innleachadh ginteil anns an robh am pGEX ath-leasaichte dearbhach (CGRP / msCT) a thoirt a-steach do mheadhan lionn LB anns an robh 50μg · mL-1 Amp, agus air a chultarach thar oidhche aig 37 ° C.Chaidh a’ chultar gu h-àrd a thoirt a-steach do bhotail 10 de mheadhan lionn LB ùr 50mL anns a bheil 50μg · mL-1 Amp aig co-mheas de 1: 100 airson cultar leudachaidh, agus nuair a bha luach OD600 aig 0.6 ~ 0.8, chaidh IPTG a chur ris a’ chruinneachadh mu dheireadh.Is e 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Às deidh inntrigeadh aig an aon teòthachd agus an aon àm, chaidh 1 mL den fhuasgladh bacterial a thoirt bhuaithe, agus chaidh na ceallan bacterial a chruinneachadh le centrifugation agus a chuir fo SDS-PAGE gus sgrùdadh a dhèanamh air buaidh diofar chruinneachaidhean IPTG air faireachdainn pròtain, agus an uairsin tagh an dùmhlachd IPTG leis an abairt pròtain as motha.
Às deidh deuchainnean, lorgar nach eil an dùmhlachd de IPTG cho mòr ‘s a ghabhas.Tha seo air sgàth gu bheil puinnseanta sònraichte aig IPTG ri bacteria.Le bhith a 'dol thairis air a' cho-chruinneachadh cuideachd marbhaidh e an cealla;agus san fharsaingeachd, tha sinn an dòchas gum bi am pròtain nas so-leònte a tha air a chur an cèill anns a 'chill, na b' fheàrr, ach ann an iomadh cùis nuair a tha an ìre de IPTG ro àrd, thèid mòran in-ghabhail a chruthachadh.Corp, ach chaidh an ìre de phròtain solubhail sìos.Mar sin, gu tric chan ann mar as motha a tha an dùmhlachd IPTG as freagarraiche, ach mar as ìsle an dùmhlachd.
Is e adhbhar inntrigidh agus àiteachadh gathan innleadaireachd ginteil toradh a’ phròtain targaid àrdachadh agus cosgaisean a lughdachadh.Chan e a-mhàin gu bheil buaidh aig factaran an t-srann fhèin agus an abairt plasmid air abairt gine targaid, ach cuideachd le suidheachaidhean taobh a-muigh eile, leithid dùmhlachd an inducer, an teòthachd inntrigidh agus an ùine inntrigidh.Mar sin, san fharsaingeachd, mus tèid pròtain neo-aithnichte a chuir an cèill agus a ghlanadh, tha e nas fheàrr sgrùdadh a dhèanamh air an ùine inntrigidh, teòthachd agus dùmhlachd IPTG gus na suidheachaidhean iomchaidh a thaghadh agus na toraidhean deuchainneach as fheàrr fhaighinn.